短串联重复序列（STR）又名微卫星重复序列，指人基因组上由2～6个核苷酸串联重复片段构成的序列。大多数STR是多态性序列，但也有一些具有致病性。STR异常扩增是脆性X综合征、亨廷顿舞蹈症等神经系统遗传性动态突变疾病的病因。2018年4月，Ishiura等[1]首次利用三代测序报道了良性家族性成人肌阵挛癫痫(BAFME)的致病变异为SAMD12基因内含子区“TTTCA/TTTTA”五核苷酸重复序列的高度异常扩增。同年底，Mizuguchi等[2]利用PacBio SMRT测序再次证实了该变异。下面小编就带大家来学习这篇文献，看三代测序如何在STR动态突变疾病的研究中大显身手。
研究策略
图1 研究思路图
样本选择
研究对象为一个有5名BAFME患者（I-1, II-1, II-7, III-1, III-2）的日本家系（系谱图如图2），家系中疾病的遗传方式为常染色体显性遗传。临床上5名患者都出现皮质震颤和癫痫症状。
图2 一个SAMD12基因致病性结构变异家系系谱图
研究内容
研究者基于Ishiura等研究BAFME的经验，直接对该家系中1名患者样本（III-2）和3名对照样本（正常人：II-2，II-7，III-6）进行PacBio Sequel 全基因组测序，平均测序深度分别为7×、8×、6×和13×。使用PBSV软件分析SV。结果表明，在患者样本III-2中共发现9138个插入和6498个缺失变异。过滤除去正常人对照样本中存在的SVs，患者样本III-2中保留有2420个插入和1086个缺失变异。进一步与RefSeq比对进行过滤，患者样本III-2中保留有1058个特异性插入和482个特异性缺失变异。其中6个SVs，包括4个插入和2个缺失变异在BAFME1连锁区域。有一段4661 bp长片段插入序列被定位在AluSq2 (chr8: 119,378,770–119,379,051) 和(TAAAA)n (chr8: 119,379,052–119,379,172) 两段重复序列之间（如图3），这与之前Ishiura等报道的位置一致。
图3 使用PBSV对PacBio SMRT测序结果中SAMD12基因进行SV分析
研究者使用RepeatMasker Open-4.0对4661 bp插入片段序列进行分析。结果显示，95.41%的序列为低复杂度序列，由GA或富含A的序列组成；短串联重复序列（AAAAT）n占3.95%（如表1）。
表1 4661bp插入序列中的重复序列
随后研究者利用Southern blot对4661 bp插入片段序列进行验证。结果显示Southern blot分析得到的序列片段大小与PacBio SMRT数据分析得到的片段大小一致（如图4）。这说明患者III-2 SAMD12基因4号内含子存在4661 bp杂合重复序列插入变异，且该结构变异与BAFME的表型共分离。
图4 Southern blot验证SAMD12基因重复序列
研究总结
该研究再次证实了SAMD12基因内含子区五核苷酸重复序列高度异常扩增是BAFME的致病原因，同时也说明了三代人基因组重测序策略在低深度下可发现STR扩增变异，这有助于明确很多目前无法解释疾病的致病变异，也有助于加速非编码区STR扩增导致其他孟德尔遗传疾病的研究，是PacBio SMRT测序技术应用于检测人基因组结构变异之短串联重复序列扩增的又一有力佐证！
参考文献
[1]Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et al. Expansions of intronic TTTCA and TTTTA repeats in benign adult familial myoclonic epilepsy[J]. Nature Genetics, 2018, 50(4): 581.
[2]Mizuguchi T，Toyota T, Adachi H, et al. Detecting a long insertion variant in SAMD12 by SMRT sequencing: implications of long-read whole-genome sequencing for repeat expansion diseases[J]. Journal of Human Genetics, 2018.